חכם יצחק שמואל רג'יו נולד לאביו חכם אברהם ויטא ולאימו בשנת תקמ"ד (1784) בעיר גוריציה שבאיטליה.
ראשית תורתו למד מפי אביו, חכם אברהם ויטא, רב העיר גוריציה. בנוסף לאיטלקית ידע צרפתית, גרמנית, ורומית, ולשונות המזרח. למד מדעים ומתמטיקה. הצליח לפתור שאלה חמורה במתמטיקה, ופתרונו נדפס בשנת תקס"ב (1802) בכתב העת 'נייווידער צייטוננ', דבר שהוציא לו שם. בשנת תקס"ג (1803) עבר לעיר טריאסטה ללמד בבית אחד מעשירי העיר., ובשנת תקס"ז (1807) שב לעיר גוריציה.
בשנת תק"ע (1810) במסגרת הסכם שנברון, בין צרפת לאוסטריה, הואחדו השטחים בחופיו הצפוניים של הים האדריאטי וצפון מזרחה של איטליה למסגרת מדינית בשליטת צרפת - הפרובינציות האיליריות. היהודים זכו לזכויות אזרח, והנציב הכללי הצרפתי מינה את חכם יצחק שמואל רג'יו לפרופ' בבית הספר למדעים. בשנת תקע"ג (1813) נכבשה גוריציה ע"י האוסטרים, וחכם יצחק שמואל רג'יו אולץ לעזוב את תפקידו.
בשנת תקע"ח (1818) פרסם בעיר וינה את החיבור 'מאמר תורה מן השמים', ובשנת תקפ"א (1821) פרסם בעיר וינה את פירושו לתורה - 'ספר תורת א-לוהים'.
בשנת תקפ"ב (1822) פרנץ הראשון, קיסר אוסטריה, חוקק חוק שחייב רבנים ללמוד לימודים כללים ובפרט פילוסופיה. חכם יצחק שמואל רג'יו קרא לייסד בית מדרש לרבנים, בו ילמדו תורה ולימודים כלליים, ואכן בית המדרש הוקם בפאדובה, ובהמלצתו הועמד בראשו, ידידו, חכם שמואל דוד לוצאטו.
בשנת תקפ"ז (1827) פרסם את ספרו החשוב 'התורה והפילוסופיה' - מחקר עיוני על לימוד החכמות. בשנת תקצ"ג (1833) ההדיר והוציא לאור עם הערותיו את הספר 'בחינת הדת' לחכם אליהו דלמדיגו. בשנת תקצ"ד (1834) ערך את אגרותיו בספר 'אגרות היש"ר', ובשנת תקצ"ה (1835) פרסם 'מאמר תגלחת' - להתיר גילוח בחול המועד. (אביו, חכם אברהם ויטא, שהתנגד להיתר, פרסם בשנת תר"ד (1844) מאמר שאין להתיר)
בשנת תר"ו (1846) לאחר פטירת אביו, החל לשמש בהתנדבות רב העיר גוריציה. בשנת תר"ט (1849) פרסם את הספר 'מזכרת יש"ר', בשנת תרי"ב (1852) את 'בחינת הקבלה', ובשנת תר"ד (1854) את 'ילקוט יש"ר'.
חכם יצחק שמואל רג'יו נפטר ביום ט"ו באלול תרט"ו (1855), ומנוחתו כבוד בעירו גוריציה.