נולד למשפחת אנוסים, ששמרה בסתר על יהדותה. בילדותו משפחתו נמלטה לאיטליה, ושבה ליהדותה בגלוי. הם התגוררו בוונציה ולאחר מכן בליבורנו, שם למד תורה מפי חכם ישראל יעקב חגיז, ששהה בליבורנו, בדרכו לירושלים, בין השנים תי"ב (1652)-תט"ו (1655). למד רפואה באוניברסיטת פיסה.
בשנת תל"ז (1676) זכה ועלה לארץ ישראל והתיישב בירושלים. הוא נמנה עם חכמי ירושלים וחתום עמהם על הסכמות ותשובות. שימש רופא ופרנס על הציבור. ותורתו קבע בישיבת 'בית יעקב ויגה' בהנהגת חתנו חכם חזקיה די סילוה, עד סגירתה בשנת תמ"ט (1689).
בשנת ת"ן (1690) החל לכתוב את ספרו 'פירוש לתורה' - דברי פשט ודרש, חכמה ומוסר, רפואה ותקנת הציבור. נשא ונתן בהלכה עם חכמי ירושלים וחברון, ושאלות ותשובות מפיו נדפסו בספר 'אורים גדולים' של בן דורו החכם אברהם ישראל זאבי מחברון. ריפא חינם את חולי העיר העניים, והשתתף בפולמוס עם השבתאים.
נולדו לו שלוש בנות ושלושה בנים. בנו חכם עזרא מלכי, מחבר הספר 'מלכי בקודש', שימש רב בעיר צפת, ורב האי רודוס. בנו חכם משה מלכי שימש רב הכפר יאסיף בגליל העליון, ובנו חכם מאיר מלכי. בתו הגדולה נישאה לחכם חזקיה די סילווה, והשנייה לחכם משה חגיז. בתו הצעירה נפטרה בצעירותו בשנת תנ"ג (1693). אשתו נפטרה בשנת תנ"ז (1697), ואחרי מותה הוא נשא אישה שנייה, שנפטרה תשעה ימים אחריו.
בשנת תס"א (1700) נקרא למיטת חוליו של רבי יהודה חסיד. בספר 'שאלו שלום ירושלים', שיצא בברלין בשנת תע"ו (1706) מספר רבי גדליה מסימיאטיץ' מספר כי "שלחו לקרוא את הרופא המומחה, שהיה בירושלים, איש ספרדי, חכם גדול בתורה ובחכמת הרפואה, ועשיר גדול הוא הרב חכם מרדכי מלכי.
חכם רפאל מרדכי מלכי נפטר בליל שבת קודש ד' באב תס"ב (1702).
בשנת תרפ"ג (1923) פרסם אליעזר ריבלין ליקוטים מספרו 'פירוש על התורה'. הקובץ יצא לאור בשנת תרפ"ז (1927) בשם: 'תקנות צבור וסדרי משפט: ליקוטים מפרוש על התורה של רפאל מרדכי מלכי'. בשנת תשמ"ה (1985) ליקט והוציא לאור חכם מאיר בניהו את הספר 'מאמרים ברפואה לרבי רפאל מרדכי מלכי.
