התייתם מאביו בגיל צעיר וגדל על ברכי אחיו הבכור. ראשית תורתו למד מפי חכם לוי בן חביב בעל ה'עין יעקב' ועיקר תורתו מפי חכם יוסף טאיטאצאק, ראש הישיבה הגדולה בשאלוניקי, שניהם דור ראשון למגורשי ספרד, שהגיעו לשאלוניקי, עם הזמנת הסולטאן ביאזיט השני, שפתח את שערי האימפריה העות'מאנית למגורשים.
בשנת רצ"א (1531), עמד בראש ישיבה בעיר שאלוניקי ואב בית דין. עמד בקשר והתדיין עם גדולי דורו, חלקם למדו בישיבתו של רבו חכם יוסף טאיטאצאק, ובתוכם חכם דוד בן זמרא וחכם בצלאל אשכנזי, בעל ה'שיטה המקובצת' ממצרים, חכם יוסף קארו בצפת, וחכם יוסף בן דוד בן לב מחכמי שאלוניקי.
בספרו שו"ת המהרשד"ם, נקבצו ע"י בנו כאלף מתשובותיו הרבות לשאלות, שהופנו אליו מכל רחבי העולם. פסיקותיו השפיעו, דורות רבים אחריו, עד ימינו. בישיבתו הנהיג שיטה ייחודית, בה עודד את תלמידיו ללימוד עצמאי וחשיבה ביקורתית. תלמידיו ישבו עמו בבית הדין, ולמדו תורה הלכה למעשה. בין תלמידיו הרבים תלמידי חכמים כמו חכם מנחם די לונזאנו בעל ה'שתי ידות', וחכם אברהם די בוטון בעל ה'לחם משנה', ואנשי מעשה: סוחרים, רופאים ואנשי מדע.
חכם שמואל די מדינה נפטר ביום ב' חשוון בשנת ש"ן (1589), ונקבר בעיר שאלוניקי.
בין תשובותיו וחידושיו: 'פסקי הגאון מוהר"ר שמואל די מדינה' יצא לאור בחייו בשאלוניקי, במספר כרכים בין השנים ש"מ-שמ"ב (1580-1582), שו"ת המהרשד"ם יצא לאור בשאלוניקי ע"י בנו חכם משה, בן השנים שנ"ד-שנ"ח (1594-1598) 'בן שמואל' - דרשות יצא לאור במנטובה ע"י נכדו חכם שמעיה, בשנת שפ"ב (1622).
