נולד בשם באלטאסאר אלוואריס במשפחת אנוסים ממוצא ספרדי, אשר קיימו את יהדותם בסתר. רבים ממשפחתו עונו נשפטו ונכלאו על ידי האינקוויזיציה בשל השמירה על יהדותם. בילדותו היגרה המשפחה מפורטוגל לספרד, והתיישבה באלקסר. בשנת שצ"ה (1635) חכם יצחק אורוביו דה קאסטרו עבר לעיר מלגה ללמוד רפואה. כעבור שנתיים בשנת שצ"ז (1637) פקדה מגיפה את העיר, והוא השתתף בטיפול בחולי העיר.
חכם יצחק אורוביו דה קאסטרו נשא לאישה את איזבל רודריגס ונולדו להם בן ובת.
ביום ז' באב תי"ד (1654) חכם יצחק אורוביו דה קאסטרו נאסר ע"י האינקוויזיציה יחד עם הוריו, אחיו ואחיותיו. מהעדויות שניתנו בבתי המשפט של האינקוויזיציה ניתן ללמוד על אורח החיים היהודי, ששמרה המשפחה, ועל מעורבותו בשמירת המסורת בתוך הבית. אחרי שהודה בעינויים על מעשיו הוא הושלך אל הכלא.
בשנת ת"כ (1660) לאחר ששוחרר ממאסרו נמלט עם משפחתו לצרפת. באותה עת, אסור היה על יהודים לגור בצרפת, והוא המשיך לשמור על יהדותו בסתר. בתחילה התגורר בבאיון, ולאחר מכן עבר לטולוז, שם שימש מרצה לכירורגיה ולפרמקולוגיה באוניברסיטת טולוז, וכן שימש כרופא של בני האצולה הצרפתית.
בשנת תכ"ב (1662) חכם יצחק אורוביו דה קאסטרו עבר לאמסטרדם על מנת לשוב ליהדות בגלוי ובלב שלם. עמו באו הוריו וחלק מאחיו. הם הצטרפו לקהילה הספרדית-פורטוגזית באמסטרדם. הוא שם שינה את שמו מבאלטאסר ליצחק, אשתו איזבל שינתה לאסתר וגם לבניהם נתנו שמות עבריים: משה וחנה.
חכם יצחק אורוביו דה קאסטרו שימש רופא בקהילה והוכר כתלמיד חכם ומלומד. תורה למד עם חכם משה רפאל דה אגילר והתייעץ עמו בענייני אמונות, דעות ופירוש התורה.
בשנת תכ"ה (1964) נבחר לשמש פרנס חברת 'ביקור חולים'. בשנת תכ"ח (1668) נבחר לשמש פרנס חברת 'עץ חיים' לתלמוד תורה. בתפקיד זה היה עליו לשמש מעין 'משגיח' התלמידים הצעירים. בשנת תכ"ט (1669) נבחר לשמש פרנס קהילת קודש 'תלמוד תורה'.
בשנת תל"א (1670) הפסיק למלא תפקידים רשמיים בקהילה, אבל המשיך לשמש רופא בהתנדבות לעניי הקהילה. לצד תפקידיו הציבוריים עסק גם ביצירה תורנית ורוחנית. היה מעורב בדו-שיח עם מלומדים נוצרים, והיה מעורב אף בפולמוסים פומביים עם יהודים, ביניהם הפולמוס על דעותיו של הפילוסוף ברוך שפינוזה.
חכם יצחק אורוביו דה קאסטרו נפטר ביום א' כסלו תמ"ח (1687) ומנוחתו כבוד בבית העלמין באודרקרק.
חיבוריו: 'מגן האמת בוויכוח על הפילוסופיה הא-לוהית והטבעית נגד עקרונות יוהנס ברדנבורג' - מאמר נגד הגותו של ברוך שפינוזה; 'אגרת חמורה נגד פארדו' - חיבור נגד הגותו של חכם דוד פארדו; 'אזהרות א-לוהיות נגד הבלי האלילות של הגויים'; 'נבואתו של דניאל על שבעים השבועות'; מאמר נגד הגותו של התאולוג הנוצרי ריימונד לול; ועוד. חלקים מחיבוריו תורגמו לעברית על ידי פרופ' יוסף קפלן.
